Linked imunološkom testu (ELISA, elisa). Suština principa metode i faze istraživanja. Analiza antitijela klase antitijela, imuno kompleksa.

U vezi sa razvojem mobilnih tehnologija, molekularne biologije, genetike, fizike, kemije i mnoge druge high-tech disciplina u svakodnevnoj praksi uvođenja novih visoke preciznosti i high-tech metoda. Ovi trendovi utjecati i interdisciplinarna područja medicinsko znanje, i srodnih oblasti bioloških, biohemijskih probleme. široko rasprostranjena i uvođenje rasprostranjena metoda kliničke laboratorijske dijagnostike, zove enzim imunoanaliza u posljednjih deset godina.

Generalno tehnologiju imunološke i enzimskih reakcija radiološke naširoko koristi u ćeliji kucanje, kulture stanica različitih tkiva od početka 80-ih godina XX vijeka. Međutim, ove metode su vrlo dugotrajan, a ne jedinstven, nisu standardizovani, koji zabranjeno njihovo korištenje u terapeutske i dijagnostičke svrhe u gomilama. Ove metode koriste uski, high-tech i visoko specijalizirane laboratorije.

Međutim, s napretkom tehnologije, microtechnology, proizvodnji različitih biopolimerni materijala od moguće proizvesti gotove seta ELISA dijagnostiku, koja će biti u mogućnosti koristiti u laboratoriju zdravstvenih ustanova generalist. ELISA se široko koristi za dijagnozu različitih infekcija (klamidija, sifilis, citomegalovirus, toksoplazmoza, herpes, itd), akutni i kronični, i latentni oblici koji se javljaju bez kliničkih simptomov.Takzhe Ova metoda se koristi za kontrolu hroničnih bolesti. Hajde da pokušamo da razumemo šta je ova metoda i kojim principima se zasniva?

Komponente povezane imunološkom testu - imuni odgovor i enzimske reakcije

Enzim imunološkog ispitivanja, kao što samo ime govori, sastoji se od dvije različite komponente - imune reakcije i enzimskih reakcija. Imuni odgovor daje obavezujuća bioloških molekula, ćelija ili mikroorganizama ćelija, koje su zapravo pokušavaju da pronađu i enzimske reakcije omogućuje nam da vidimo i izmjeriti rezultat imunološku reakciju. To jest, imuni odgovor - je dio kompleksa tehnike, koji je zapravo otkriva željeni mikroba. A enzimskih reakcija - je onaj dio kompleksnog tehniku, koja omogućava da prevede rezultat imunog odgovora u obliku oka vidljivi i dostupni za mjerenje rutinskih kemijske tehnike. na takav način strukturu imunološkog ispitivanja na bazi, analizirali smo obe strane odvojeno.

Imuni odgovor je to? Ono što je antitijelo, antigen?

Šta je imunološki odgovor? Što je antigen?
Prva analizirati ono što imunog odgovora. imunološki odgovor - specifična vezivanja reakcije antigen s antitijela da formiraju imuno kompleksa. Šta to znači? Na površini svake ćelije svakog organizma postoje posebne strukture zove antigeni. Antigeni općenito - su molekule koje nose informacije o ćeliji (poput informacija o značku kod ljudi, koji određuje osnovne podatke osobe).

Pojedinačne i specifične antigene - što je to? Zašto nam je potrebna ova antigena?

ima pojedinačne antigene, koji je jedinstven za ovaj organizam. Ove pojedinačne antigene se razlikuju od svih ljudi, tu je međusobno slične, ali ipak različite. Dvije identične kopije pojedinih antigena ne postoji!

Drugi glavni tip antigena - je vrsta antigena, koji je svojstven u bilo koje vrste živih bića. Na primjer, osoba je prisutan određeni antigen koji je zajednički svim ljudima, kod miševa postoji Murine antigen vrsta, itd Na površini svake ćelije nužno predstaviti vrste i pojedinca antigena.

Specifični antigen koristi ćelije imunog sistema za prepoznavanje. "- drugog"

Kako je priznanje antigen?

Ćelije imunog sistema u vezi sa sumnjivim ćelije i nosi identifikacija na pojedinca antigena. Imunološki memorije "napisano" ćelija izgleda kao "svoj antigen." Stoga, ako antigen sumnjive ćelije odgovara opisu "svoj antigen", to znači da je ćelija svoje tijelo, a ne ozbiljno. Onda imunološki ćelije "odvezao" i odlazi. A ako antigen nije isto kao opis "a", dok imuni ćelije identificira ćeliju kao "strani" a samim tim i potencijalno opasan za cijeli organizam. U ovom slučaju, imunološki ćelija nije "odvezao" i počinje da uništi opasne objekta. Tačnost tih imunoloških priznanje je nevjerojatna - 99,97%. praktično bez greške!

Ono što je antitijelo imuni kompleks?
Ono što je antitijelo?

Antitijela - poseban molekula koji se nalazi na površini imunih ćelija. To antitijelo veže za antigen i sumnjive ćelije. Dodatne informacije prenosi antitijela u ćeliju, gdje priznavanje, i prima povratak signal dva tipa "a" ili "protivnika". Kada je signal "a" antitijelo remeti komunikaciju sa antigena i oslobađa ćelije.

Što je imuni kompleks?
Kada je signal "strani" situacija odvija drugačije. Antitijela ne prekine vezu sa antigena, i obrnuto, slanjem specifične signale, izaziva "pojačanje". Biološki to znači da drugi antitela u drugom dijelu ćelije počinju da se presele u oblasti u kojoj postoji opasnost signal, i formiraju vezu između antigena i uhvaćen. Na kraju, antigen je okružen sa svih strana i čvrsto privyazan.Takoy antigen + antitijela zove imuni kompleks. Od tog trenutka, odlaganje antigena. Ali sada detalje procesa neutralizacije antigena nismo zainteresovani.

Tipovi antitijela (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Antitijela - protein strukturu, koja odnosno imaju hemijski naziv, koji se koristi kao sinonim za izraz antitijela. Prema tome, antitijela su imunoglobulini =.

Postoji pet vrsta imunoglobulina (Ig), koji se vezuju za različite vrste antigena na različitim mjestima ljudskog tijela (npr kože, sluznica, krv, i tako dalje. d.). To jest, antitijela imaju podjelu rada. Ovi imunoglobulini se zovu latinicu - A, M, G, D, E i su označeni na sljedeći način - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

U dijagnostici koriste samo jednu vrstu antitijela koja je najviše specifična za definisane mikroba. To jest, vezivanja antitijela su definirani s antigen uvijek dogodi. Najčešće se koristi IgG i IgM.

Ovaj princip imuni odgovor (jedinstvena specifičnost i točnost prepoznavanja određuje biološki objekt) u osnovi imunosorbentnim analiza.V snagu visoke preciznosti antitijela prepoznavanje antigena, tačnost svih metoda imunoanaliza je superioran.

Enzimske reakcije

Šta reakcija - enzima? Koja je afinitet podloge i proizvoda?
Mi sada razmotriti reakcije enzimskih u metodi enzim imunoanaliza.

Ono što je enzimske reakcije?

Enzimske reakcije - hemijske reakcije u kojima je jedna supstanca je pretvoren od strane enzima u drugi. A supstanca koja djeluje na enzim podloge. Supstanca koja se dobija uticaj enzim reakcija proizvod. Pri čemu je karakteristika enzimskih reakcija je da se određeni enzim djeluje samo na određenu podlogu. Ova nekretnina enzima da prepozna "svoje" podlogu pod nazivom sklonost.

Prema tome, svaki enzim nosi samo jedan, specifičan odgovor na to. Enzimi u biološkom svijetu zna veliki izbor, kao i enzimskih reakcija. ELISA dijagnostički koristi samo nekoliko enzimskih reakcija - ne više od 10. Kada je ova odabrana kao što enzimskih reakcija proizvod koji se boji supstanci. Zašto je enzimskih reakcija proizvodi moraju biti obojen? Budući da ne postoji jednostavna metoda kemijske za izračunavanje koncentracije tvari u boji rješenja - kolorimetrija.

kolorimetrija metoda - suština i princip

kolorimetrija koristi mjerenje gustoće boje rješenja i gustina boja izračunati koncentracija veschestva.Pri ovaj poseban uređaj - kolorimetrom mjere boju gustoće rješenja. U kolorimetrija dva moguća gustoće boje u zavisnosti od koncentracije supstance - direktno je proporcionalna ovisnost ili obrnuto proporcionalna. U direktnoj proporciji, što je veća koncentracija supstance, više intenzivne gustina boja rješenja. U obrnutoj proporciji, to je veća koncentracija supstance, donja boja gustoće rješenja. Tehnički, to se odvija na sljedeći način: uzeti nekoliko rješenja za poznate koncentracije gustoće tvari mjereno od ovih rješenja, koncentracija se nanosi na gustoću boje (kalibracija grafikon).

Zatim, mjerenje gustoće boje otopine, koncentracija koja se pojavljuje, i kalibraciju grafikona su koncentracije vrijednost odgovara na nivo izmjerene gustoće boja rastvora.V modernim automatskim colorimeters kada je kalibracija izvršena, onda je sama jedinica konstruiše kriva kalibracije, koji ostaje u memoriji, i mjerenje automatski.

peroksidaze: Odgovor imunoanaliza se najčešće koristi sljedeće enzime alkalne fosfataze, avidin.

Kao što je u kombinaciji imunološke i enzimskih reakcija u ELISA? Sada ćemo nastaviti da razmotri stvarnu enzim imunoanaliza. Koje su faze uključuje i ono što se događa kada te reakcije? Linked imunosorbentnim testa je direktne i indirektne.

Direktnim povezane immunosorbent test - faze

U direktnom ELISA korištenjem antitijela za identifikaciju antigen u kombinaciji sa specifičnim etiketom. Ova posebna oznaka je supstrat enzimske reakcije.

Postavljanje antigena na površinu antigen i spoj bunara sa antitijela

Kako se direktno enzim imunoanaliza? Uzmite biološki materijal (krv, sluz strugotina, mrlje) i staviti u posebnim bunara. Biološki materijal ostaje u bunara za 15-30 minuta na antigene mogao držati na površinu bunara. Nadalje, u ovim bunarima se dodaje antitijelo za detekciju antigena. To znači da identifikovanje antigene, kao što su sifilis, dodao antitijela protiv sifilisa antigena. Ova antitela su proizvedeni industrijski metode i laboratorijske kupiti spreman nabory.Dannuyu mješavina materijala i antitela ostaviti za neko vrijeme (od 30 minuta do 4-5 sata), do antitijela su bili u stanju da pronađu i stupiti u kontakt sa "njihovim" antigenom.Chem više u biološkim antigena uzorka, više kontakt antitijela s njima.

Uklanjanje "nepotrebne" antitijela

Kao što je spomenuto, antitijela također se odnose na specifične metkoy.Poskolku antitijela se dodaju u višak, nisu svi od njih će biti kontaktirani s antigenima, a ako nema antigena u uzorku, a zatim, u skladu s tim, ni antitijela ne kontaktira sa željenim antigena. Da biste uklonili "ekstra" antitijela, sadržaj bunara samo sipa. Kao rezultat toga, svi "višak" antitijela su uklonjeni, a oni koji su povezani sa antigenima kao antigeni "zalijepljen" na površinu bunara. Bunara su ispere nekoliko puta s posebnim rješenje, što vam omogućava da oprati sve "ekstra" antitijela.

Enzimske reakcije - formiranje boji spoj

Tada počinje druga faza - na enzimske reakcije. Oprano bunari su dodati enzim rješenje i ostaviti da odstoji 30-60 minuta. Ovaj enzim ima afinitet na supstancu (specifična tag), koji je povezan sa antitijela. Reakcije enzima su sprovedene, kao rezultat koji ovaj oznaka (supstrat) se pretvara u boji tvari (proizvoda). Onda metoda kolorimetrija su da je koncentracija obojene supstance. Pošto je ovo specifična oznaka je povezana sa antitela, onda je koncentracija u boji reakcije proizvod je jednak koncentraciji antitijela. Koncentracija antitijela jednaka antigenprezentujuće koncentracije. Dakle, kao rezultat analize, dobijemo odgovor, što je koncentracija otkrivenih mikroba ili hormona.

To je ono što prolazi ravno imunosorbentnim test. Danas, međutim, češće koriste indirektne imunosorbentnim test, jer je osjetljivost i preciznost indirektnih veći nego direktno. Dakle, da indirektne enzim imunoanaliza.

Indirektni enzim imunoanaliza - faze

U indirektni ELISA dvije faze. U prvoj fazi se koriste neoznačeno antitijela na otkriti antigene, au drugoj fazi se primjenjuje na prvom oznakom antitijelo neoznačena antitijela. To se ne dobija direktno vezivanje antitijela na antigen, i dvostruko provjeru: vezivanje antitijela na antigen, nakon čega vezivanje drugog kompleks antitijelo sa antitijela + antigen. Tipično, antitijela za prvu fazu - miš i za drugi - koza.

Fiksacija antigena na površini bunara i vezivanje antigena sa neoznačeno antitijelo
Baš kao što je za direktnu enzim imunoanaliza obavlja ograda biološkog materijala - krv strugotina, mrlje. Istraživala biološki materijal se dodaje bunara i ostaviti da odstoji 15-30 minuta za vezivanje na površinu antigena bunara. Zatim bunara doprinose neoznačeno antitijela na antigene i dozvoljeno na vrijeme (1-5 sati) na antitijela kontaktirao sa "svoje" antigene i imunološki kompleks formiran (prva faza). Zatim uklonite "višak", nevezane antitijela sipanjem sadržaja bunara. Ispiranje sa posebnim rješenje za potpuno uklanjanje svih nevezani antitijela.

Vezivanje oznakom antitijela na antigen, što je neoznačenih antitijela +
Onda uzmi drugi antitela - oznakom, dodaju u bunarima i ponovo da odstoji neko vreme - 15-30 minuta (revanšu). Tokom tog vremena, označen antitijela se vežu za prvi - nije označen i formiraju kompleks - antitijela + antigen + antitijela. Međutim, označen, a oznakom antitijelo se uvode u bunare u višak. Zbog toga je potrebno ponovo ukloniti "ekstra", već označena antitijela koji ne obavezuju na neoznačena antitijela. Ovaj postupak se ponavlja za pretakanje sadržaja bunara i pranje sa posebnim rješenje.

Enzimske reakcije - formiranje boji spoj
Onda uvesti enzim obavljanje reakcija konverzije "oznaka" u boji supstance. Boja razvija u roku od 5-30 minuta. Zatim se vrši kolorimetrija i izračunavanje koncentracije obojene supstance. Budući da je koncentracija u boji supstance je označen koncentracija antitijela i koncentracija tragač jednaka koncentracija neoznačeno antitijela, što je jednaka koncentracija antigena. Tako smo dobili koncentraciju antigena otkriti.
Takav dual kontrole pomoću dvije vrste antitijela pojačane osjetljivosti i specifičnosti imunoenzimske test. Uprkos produženje vremena za analize i uključivanje dodatne korake, ovi gubici se kompenziraju preciznost rezultat. Zato je u ovom trenutku velika većina enzima tehnike imunoanaliza - ovo je indirektan enzim imunoanaliza.

Šta bolesti su otkrivene od strane enzima imunoanaliza dijagnostike?

Pogledajmo sada kakve bolesti i bilo koji biološki aktivne supstance otkriju enzim imunoanaliza. Supstance detektuje enzim imunoanaliza su prikazani u tabeli.


Tabela u nastavku nije kompletna lista testova (samo najčešći), obavlja ELISA. Donijeti cijeli popis nije moguće, jer će biti vrlo velika i stalno ažuriraju. Pored laboratorijske dijagnostike enzima imunoanaliza se naširoko koristi u naučnim istraživanjima.




Autor: AK Nasedkina