PCR (lančana reakcija polimeraze). Kako se dijagnoza PCR, indikacije, kako se pripremiti za studije, PCR rezultati

Za adekvatan i efikasan tretman mnogih zaraznih bolesti mora biti pravovremeno uspostaviti precizne dijagnoze. U rješavanju ovog problema danas bave high-tech dijagnostičkih metoda zasnovana na metodama molekularne biologije. U ovom trenutku, lančana reakcija polimeraze (PCR) se već naširoko koristi u medicinskoj praksi kao najpouzdaniji alat za laboratorijsku dijagnostiku.

Ono što čini popularnost PCR u ovom trenutku?

Prvo, ova metoda se koristi za detekciju patogena raznih zaraznih bolesti s visokom preciznošću.

Drugo, za praćenje efikasnosti liječenja.

U različitim priručnike, brošure, članke i objašnjenja medicinskih stručnjaka, često smo suočeni sa upotrebom opskurnih termina i riječi. Zaista je teško govoriti o high-tech proizvoda znanosti uobičajeno riječi.

Šta je suština i mehanike za dijagnostiku PCR?

Svaki živi organizam ima svoju jedinstvenu gena. Geni su raspoređeni u DNK molekulu, što je u stvari "kartice" svakog konkretnog organizma. DNK (genetski materijal) - veoma dug molekula koja se sastoji od "cigle" pod nazivom nukleotida. Svaki exciter leže strogo specifične zarazne bolesti, i.e. u određenoj sekvenci i kombinaciji. Kada je potrebno da shvate da li ta osoba ima određeni patogen, penje se biološki materijal (krv, urin, pljuvačka, bris), koji se sastoji od DNK ili fragmenata DNK mikroba. Ali količina genetskog materijala patogena je vrlo mala, a to je nemoguće reći šta mikroorganizam on posjeduje. Riješiti ovaj problem i služi kao PCR. Suština lančana reakcija polimeraze je da je mala količina materijala se uzima za istragu, koja se sastoji od DNK, a proces PCR je povećanje broja genetski materijal pripadaju određeni patogen i tako se može prepoznati.

PCR dijagnostika - genetska studija biomaterijala.

Ideja PCR pripada američkom naučniku K.Mullins, koju je predložio 1983. godine. Međutim, rasprostranjeno kliničkoj upotrebi je dobila tek sredinom 90-ih XXveka.

Mi ćemo razumjeti terminologiju to je to - DNK, itd Svaka ćelija svakog živog bića (životinje, biljke, ljudska, bakterija, virusa) ima kromosoma. Hromozoma - čuvari ove genetske informacije, koje čine cijelu sekvencu gena svakog pojedinca živo biće.

Svaki kromosom se sastoji od dva DNK lanaca, uvijeni u spiralu u vezi sa svakim drugim. DNK - dezoksiribonukleinske kiseline je hemijski, koji se sastoji od strukturnih komponenti - nukleotida. 5 je nukleotid vrsta - timin (T), adenozin (A), guanin (G), citozin (C) i uracil (U). Nukleotidi su raspoređeni jedan iza drugog u strogom slijed pojedinačnih formiranja gena. Jedan gen se može sastojati od 20-200 nukleotida takve. Na primjer, gen kodiranje za proizvodnju inzulina, sastoji se od 60 bp.

Nukleotida su vlasništvo komplementarnosti. To znači da za razliku od adenin (A) u jednom lanac DNK potrebno je timin (T) na drugi lanac, a nasuprot guanin (G) - citozin (C). Shematski kako slijedi:
D - D
T - A
A - T
Ovaj Ključno svojstvo komplementarnosti za PCR.

Osim DNA istu strukturu je RNK - ribonukleinske kiseline, koji se razlikuje od DNK u tome, umjesto timina, uracila se koristi u njemu. RNK - genetska informacija je čuvar neki virusi, pod nazivom retrovirusa (kao što je HIV).

       DNA i RNA molekula može biti "umnožiti" (U ovom objektu se koristi za PCR). To se dešava i to: dva niza DNK ili RNK, polaze od svake druge strane, svaka nit dobija poseban enzim koji sintetizira novi lanac. Sinteza je princip komplementarnosti, odnosno, ako je u originalnom DNK lanac vrijedan nukleotida A, onda novosintetisanih će biti T, ako je T - onda C, itd Ovaj poseban enzim "graditelj" potrebna "sjemena" za početak sinteze - slijed nukleotida 5-15. Ovaj "sjeme" je definiran za svaki gen (gen klamidije, mikoplazme, virusi) eksperimentalno.

Prema tome, svaki PCR ciklus sastoji se od tri koraka. Prvi korak javlja tzv odmotavanje DNK - to je međusobno razdvajanje dva DNK. U drugom - je "sjeme" na stranicu DNK lanaca. Konačno, proširenje podataka niti DNK, koji je napravljen fermentom- "graditelj". U ovom trenutku to složen proces se dešava u jednom cijevi i sastoji se od ponavljajućih ciklusa reprodukcije definirane DNK proizvesti veliki broj primjeraka koji se mogu naknadno otkrivena konvencionalnim metodama. To je jedan od DNK dobijamo stotine ili tisuće.

Faze studija PCR

Uzimanje uzoraka biološkog materijala za istraživanje

Kao što je uzorak različitih biološki materijal, krv i njene komponente, urin, pljuvačka, nadražaj sekreta, likvora, sekret rane površine, sadržaj šupljina tijela. Svi biološkim testovima prikupljeni za jednokratnu upotrebu instrumenata, i biranih materijala uklopiti u sterilnom plastičnom cijevi ili stavlja na kulturu srednje sa naknadnim transport u laboratoriju.

Preuzete uzorak se dodaje potrebne reagense i staviti u programabilni termostat - thermo (amplifikatoru DNA). U thermo PCR ponoviti 30-50 puta ciklus koji se sastoji od tri faze (denaturacija, žarenje i istezanje). Šta to znači? Razmislite o detaljima.

Faze zloupotrebljavaju PCR reakcije, kopiranje genetskog materijala

ja faza PCR - Priprema za kopiranje genetskog materijala.
Javlja se na temperaturi od 95 ° C, DNK su odvojeni, i oni mogu sjesti "bukvar".

"Podloge" su proizvedeni industrijski metodama različitih naučnih i industrijskih udruženja i laboratorija kupiti gotove. Je "sjeme" za identifikaciju, kao što su klamidija, radi samo za klamidiju, itd Prema tome, ako je biomaterijala je testiran na prisustvo Chlamidijama infekcije, onda je reakcija smjesa se stavlja "sjeme" za hlamidiy- ako testiranje biomaterijala na virus Epstein-Barr, i "sjeme" za virus Epstein-Barr.

II faza - sindikat genetskog materijala od infektivnog agensa i "sjeme."
Ako postoji DNK definisan virus ili bakterija, "sjeme", nalazi se na DNK. Proces pridruživanja "sjemena" je druga faza PCR. Ovaj korak se odvija na temperaturi od 75 ° C.

III faza - Kopija genetskog materijala infektivnog agensa.
Ovaj proces zapravo produljenje ili razmnožavanje genetskog materijala, koji se javlja na 72 ° C. Pod "sjeme" je pogodan enzim "graditelj" i sintetizira novi lanac DNK. Sa završetkom sintezu novog lanca DNK krajevima i ciklus PCR. To jest, jedan PCR broj ciklusa je povećan genetski materijal dva puta. Na primjer, u izvornom uzorku imala 100 molekula DNK bilo kojeg virusa, nakon prvog PCR ciklusa u uzorku biti molekule DNK za 200 test virusa. A ciklus traje 2-3 minuta.

Za formiranje dovoljne količine genetskog materijala za identifikaciju, uglavnom 30-50 ciklusa PCR su izvedeni, koji traje 2-3 sata.

Tier Identifikacija propagira genetski materijal

Zapravo PCR završava ovdje i dalje ne postoji manje značajne fazi identifikacije. Za identifikaciju metodom elektroforeze ili oznakom "bukvar". Kada se koristi za elektroforezu dobiti DNK odvojen po veličini, kao i prisustvo DNA fragmenata različite dužine ukazuje na pozitivan rezultat analize (i.e., prisustvo virusa, bakterija, itd.) Kada se koristi sa oznakom "sjeme", dodaje se hromogen (boja) do finalnog proizvoda reakcije, pri čemu se enzimskih reakcija u pratnji formiranje boje. Boja razvoj je direktan dokaz da su prisutni u izvornom uzorku virus ili neki drugi otkriti agent.

Do danas, koristeći oznakom "bukvar", kao i odgovarajući softver, moguće je proizvesti odjednom i "pročitati" rezultati PCR. Tako je nazyvaemayareal-time PCR.

Zašto dijagnostika PCR ima tu vrijednost?

Jedan od značajnih prednosti metode PCR je veliku osjetljivost - 95 na 100%. Međutim, ove prednosti treba da se zasniva na uvijek sledećim uslovima:

1. ispravne uzorkovanja, transporta biološkog materijala;
2. dostupnost sterilnih, za jednokratnu upotrebu instrumenata, specijalizirane laboratorije i obučeno osoblje;
3. strogo pridržavanje sterilnih tehnika i prilikom analize

Osjetljivost varira za različite bakterije otkrivene. Na primjer, osjetljivost metode PCR za detekciju virusa hepatitisa C je 97-98%, osjetljivost za detekciju Ureaplasma - 99-100%.

Mogućnosti svojstvene PCR analiza, može postići bez premca analitička specifičnost. To znači identifikaciju mikroorganizama je da tražim, a ne slične ili blisko povezane.
Dijagnostičke osjetljivosti i specifičnosti metode PCR, često premašuju one za metodu kulture, pod nazivom "zlatni standard" za otkrivanje zaraznih bolesti. S obzirom na trajanje rastuće kulture (od nekoliko dana do nekoliko tjedana), prednost PCR je evidentna.

PCR u dijagnostici infekcije
Prednosti metode PCR (osjetljivost i specifičnost) definirati širok spektar primjene u modernoj medicini.
Glavne aplikacije PCR dijagnostiku:

1. Dijagnoza akutne i hronične infektivnih bolesti različitih lokalizacija
2. praćenje učinkovitosti terapije
3. pojašnjenje vrstu patogena

PCR se koristi u akušerstva, ginekologije i neonatologiju i pedijatriji, urologije, spolne bolesti, nefrologije, zarazne bolesti klinika, oftalmologiju, neurologiju, Phthisiopneumology et al.

PCR dijagnostika se obavlja zajedno sa drugim istraživačkim metodama (ELISA, PIF, FIF i dr.). Njihova kombinacija i određuje prikladnost lekar.

infektivne agense otkrivene metodom PCR

virusa:

1. Retrovirusa HIV-1 i HIV-2
2. herpetiformis virusa
3. vrste herpes simplex virus 1 i 2
4. citomegalovirus
5. Epstein-Barr virus
6. Varicella - zoster virus
7. ljudski herpes virusa 6 i 7
8. hepatitis C, B i A
9. virusi, ljudski papiloma
10. virus rubeole
11. adenovirusi
12. rinovirusi
13. parvo
14. pikornovirusy

bakterije:

1. mikobakterije
2. klamidiju
3. mikoplazme
4. salmonele
5. Legionella
6. klostridije
7. blijedo Treponema
8. Razne vrste patogenih E. coli
9. Vibrio cholerae
10. rikecije
11. aurococcus
12.  uzročnika bakterijskog meningitisa
13. Helicobacter pylori
14. ureaplazma
15. gonoreja
16. difterije bacillus
17. Haemophilus influenzae

Na ovoj listi su najčešće infektivne agense otkrije PCR. U stvari, ova lista je mnogo širi, stalno ažuriraju, kao sintetiziran novi "sjeme." Također treba napomenuti da je spisak identifikovanih patogena određuje prisustvo "sjemena" za identifikaciju u arsenalu svakog pojedinca laboratorija.


Autor: AK Nasedkina